Cell therapy in experimental model of inflammatory bowel disease / Terapia celular em modelo experimental de doença inflamatória intestinal

Inflammatory bowel disease, which mainly involves Crohn's disease and ulcerative rectocolitis, is an inflammatory condition of the mucosa that can afflict any segment of the gastrointestinal tract. Despite the fact that the existing therapies result in improvement in patient's symptomatology and quality of life, there is no curative treatment. Surgical treatment involves complex procedures associated with high morbidity and mortality rates. In this context, cell therapy with stem cells has emerged as a treatment with broad potential applicability. In this study, we intended to verify the efficacy of transplantation of adipose tissue-derived stem cells in rats with intestinal inflammation induced by trinitrobenzenesulfonic acid. The cell population was isolated from the adipose tissue of inguinal region of rats and processed for culture by mechanical dissociation. The animals were evaluated with respect to clinical and biochemical aspects, as well as by macroscopic, microscopic and histological analyses. In the experimental model of bowel inflammation by 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid, the infusion of adipose tissue significantly reduced the presence of adhesions in the colon and adjacent organs and decreased the activity of myeloperoxidase, a marker of neutrophil infiltration in the injured mucosa. The results suggest that cell therapy with adipose tissue can promote and/or accelerate the regeneration of damaged intestinal mucosa. It is concluded that the presence of adhesions and the determination of myeloperoxidase activity provide indications that adipose tissue can promote and/or accelerate the regeneration of inflammatory bowel mucosa. (AU)

A Doença Inflamatória Intestinal (DII), consistindo principalmente da doença de Crohn e retocolite ulcerativa, é uma condição inflamatória da mucosa que pode acometer qualquer segmento do trato gastrointestinal. Apesar das terapias existentes resultarem na melhora dos sintomas e da qualidade de vida dos pacientes, não há nenhum tratamento curativo. O tratamento cirúrgico envolve procedimentos complexos associados a altas taxas de morbimortalidade. Neste contexto, a terapia celular com células-tronco desponta como opção de tratamento potencialmente promissora. Em função destes aspectos, pretendeu-se, no presente estudo, verificar a eficácia do transplante de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASC) em ratos com inflamação intestinal induzida por ácido trinitrobenzenosulfonico (TNBS). As ASCs foram obtidas por dissociação mecânica do tecido adiposo da região inguinal de ratos e processadas para cultivo. Os animais foram avaliados, considerando-se os aspectos clínicos e bioquímicos, além de análises macroscópica, microscópica e histológica. No modelo de inflamação intestinal induzida por TNBS, a infusão de ASCs reduziu significativamente a presença de aderências entre o cólon e órgãos adjacentes, bem como diminuiu a atividade da mieloperoxidase (MPO), um marcador da infiltração de neutrófilos na mucosa lesada. Os resultados obtidos permitem concluir que a terapia celular com ASCs pode promover e/ou acelerar o processo de regeneração da mucosa intestinal inflamada. (AU)

Cultura de condrócitos em arcabouço tridimensional: hidrogel de alginato / Chondrocyte cultures in tridimensional scaffold: alginate hydrogel

OBJETIVOS: O presente estudo teve como objetivo cultivar condrócitos retirados da articulação do joelho de coelhos encapsulados em hidrogel de alginato (HA) e caracterizar a produção de matriz extracelular (ECM). MÉTODOS: A cartilagem articular foi removida do joelho de coelhos, com três a seis meses, fragmentada em pedaços de 1mm e submetida à digestão enzimática. Uma concentração de 1x106 céls/mL foram ressuspensas em uma solução de alginato de sódio a 1,5 por cento (w/v), em seguida fez-se o processo de gelatinização em CaCl2 (102 mM), permitindo a formação do HA e cultivo em meio DMEM-F12 durante quatro semanas. A distribuição das células e a ECM foram acessadas através das secções histológicas coradas com e azul de toluidina hematoxilina e eosina (HE). RESULTADOS: Houve um aumento no número e na viabilidade dos condrócitos durante as quatro semanas de cultura. Através das análises histológicas dos HAs corados com azul de toluidina e HE foi possível observar a distribuição definida dos condrócitos no hidrogel, assemelhando-se a grupos isógenos e formação de matriz territorial. CONCLUSÃO: Este estudo demonstrou a eficiência do HA como arcabouço para ser usado na cultura de condrócitos, constituindo uma alternativa no reparo de lesões na cartilagem articular.

OBJECTIVES: The aim of this study was to culture chondrocytes from knee joint cartilage of rabbits encapsulated in alginate hydrogel (HA) and to characterize the production of extracelular matrix (ECM). METHODS: Joint cartilage was obtained from rabbits' knees, three to six months old, fragmented into 1-mm pieces and submitted to enzymatic digestion. A concentration of 1x106 cells/mL were re-suspended into a 1.5 percent (w/v) sodium alginate solution, followed by gel formation process with CaCl2 (102 mM), allowing HA to build for culturing it into a DMEM-F12 medium for four weeks. The distribution of cells and ECM were assessed from histological slices stained toluidine blue and hematoxyline-eosin (HE). RESULTS: There was an increase of the number and viability of the chondrocytes during the four weeks of culture. By assessing the histological sections stained with toluidine blue and HE, we could note the definitive distribution of chondrocytes in the hydrogel, similarly to isogenous groups and territorial matrix formation. CONCLUSION: In this study, the alginate was shown to be an effective scaffold for use in chondrocytes culture, constituting an alternative for repairing joint cartilage defects.

Diferenciação de célula-tronco hematopoética periférica humana em osteoblasto sobre diferentes superfícies de implantes de titânio / Cell differentiation of human haematopoietic stem cell (hHSC) to osteoblast in different surfaces of titanium implant

A associação dos implantes de titânio com tecido ósseo desenvolvido em cultura poderá contribuir para o tratamento de casos clínicos complexos. O objetivo deste trabalho foi viabilizar a formação do tecido a partir da cultura de célula-tronco hematopoética periférica humana (CTHPh) e avaliar o seu crescimento em implantes de titânio, com diferentes superfícies e tamanhos, para definir o melhor resultado. As CTHPhs foram coletadas no sangue periférico por aféresis e cultivadas em meio D-MEN modificado, em placas de cultura com 24 poços, onde foram incluídos implantes de titânio de 3 e 7mm com superfície lisa e texturizada (por jateamento e ataque de ácido), durante 29 dias. A cultura, com corpo-de-prova identificado, teve “cultura controle” sem o corpo-de-prova. Foram avaliados: adesão celular, após 4 horas da inclusão e no 280 dia (D28); curva de crescimento (D1 e D28); atividade da fosfatase alcalina e proteínas totais dos sobrenadantes das culturas (4 horas e D4, D6, D9, D12, D16, D22, D28). Usou-se estatística descritiva na apresentação dos resultados. Concluiu-se que o tamanho dos implantes (3 ou 7mm) não influenciou no desenvolvimento da cultura; quanto à superfície, os implantes texturizados mostraram maior crescimento e adesão celular, maiores valores de atividade da fosfatase alcalina e proteínas totais, apontando para efeito favorável na formação de tecido ósseo in vitro.

The association of titanium implants with cultured bone tissue could contribute to the treatment of complex affections. The aim of this study was to obtain tissue formation from human haematopoietic stem cell (hHSC) and to evaluate the growth in titanium implants, with different surfaces and sizes in order to determine the best results. The hHSC was obtained from blood and cultured for 29 days in 24-well tissue culture plates containing Dulbecco's modified essential medium (Gibco®) and titanium implants of 3 and 7mm with smooth and rough surfaces. Negative controls were included. Were evaluated: cell adhesion after 4 hours of inoculation and again at day 28 (D28): growth curve at day 1 (D1) and day 28 (D28): activity of alkaline phosphatase and total protein from culture supernatant (4 hours, D4, D6, D9, D12, D16, D22, D28). Were applied descriptive statistics to the data. It was concluded that the size of implant (3 or 7mm) did not interfere with development of the culture. Rough surface implants showed increased growth and cell adhesion, greater alkaline phosphatase and total proteins activity, indicating favorable effect to the formation of bone tissue in-vitro.

Cultura de condrócitos para o uso terapêutico: reconstituição de cartilagem / Culture of chondrocytes for the therapeutic use: restoration of cartilage

A cartilagem articular é um tecido avascular com números limitados de condrócitos, com capacidade limitada de reparo após uma lesão aguda. As técnicas disponíveis atualmente para o tratamento de lesões de cartilagem articular podem resultar em alívio dos sintomas, mas não na regeneração do tecido lesado. A geração de um substituto biológico que recomponha a cartilagem articular nativa requer células vivas que sejam capazes de sintetizar e manter a matriz cartilaginosa. A engenharia de tecidos constitui recentemente uma metodologia para reconstrução de novos órgãos e tecidos que foram lesados e apresentam dificuldades na reparação. Um dos maiores avanços no campo da engenharia de tecidos e dentro da medicina ortopédica, tem sido, o recrutamento de tecido do próprio paciente, que são dissociados em células e cultivadas sobre suportes biológicos ou sintéticos, conhecidos como scaffolds, para posterior realização de implante de condrócitos, com intuito de regenerar o tecido cartilaginoso lesado. Uma variedade de scaffolds como hidrogel e polímeros sintéticos, têm sido investigadas para a expansão dos condrócitos in vitro para o reparo da cartilagem lesada. Tais matrizes incluem: arcabouços à base de colágeno: gel de colágeno tipo I e II, esponjas de colágeno tipo II, ácido polilático e ácido poliglicólico, fibrina, óxido de polietileno, fibrina, peptídeos, alginato e gel de plaquetas. No presente trabalho desenvolvemos diferentes metodologias de cultura de condrócitos, utilizando scaffold sintético hidrogel de alginato e biológico gel de plaquetas obtido a partir do Plasma Rico em Plaquetas - PRP, além da cultura de condrócitos em pellet tridimensional, objetivando encontrar a melhor metodologia para a realização de implantes de condrócitos. Como modelo experimental escolhemos coelhos, tanto para coleta da cartilagem articular como para obtenção do plasma sanguíneo e realização dos implantes alogênicos...

Isolamento de células-tronco mesenquimais da medula óssea / Isolation of bone marrow mesenchymal stem cells

As Células-Tronco Mesenquimais (CTMs) têm alta capacidade de se renovar e diferenciar em várias linhagens de tecido conjuntivo. Este trabalho teve como objetivo isolar as CTMs da medula óssea de camundongos utilizando dois diferentes meios de cultura e caracterizá-las através de imuno-marcação com anti-vimentina. Foram utilizados 6 camundongos BALB/c com 15 dias de idade. A medula óssea foi coletada do canal medular das tíbias e fêmures dos camundongos e ressuspensas em uma concentração final 6x10(5), em meio Knockout- DMEM e DMEM alta concentração de glicose, suplementados com 10 por cento SBF, mantidas em estufa a 37° C em uma atmosfera úmida a 5 por cento de CO2 e 95 por cento de ar por 72 horas, quando as células não aderentes foram removidas durante a troca do meio. O número e densidade de células com morfologia fibroblastóide foram maior no meio Knockout- DMEM em cinco dias de cultura versus 10-20 dias para conseguir a mesma concentração celular com o DMEM alta concentração de glicose. As células de ambos grupos apresentaram intensa marcação com anticorpo anti-vimentina, caracterizando-as como CTMs. A obtenção mais rápida das CTMs é fundamental para o campo da terapia celular, principalmente quando se deseja utilizar estas células no reparo de tecidos de origem mesenquimal.